Безопасность лечебного напитка

Доклинические и клинические исследования

Часто задаваемые вопросы

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ СТАБИЛИЗИРОВАННОГО ВОДНОГО РАСТВОРА С ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В ОРГАНИЗМЕ МЫШЕЙ

ОТЧЕТ

Данные исследований противовирусной активности стабилизированного водного раствора с восстановительными свойствами (далее «СВРВС») в культурах клеток привели к необходимости изучить влияние физиологического раствора, приготовленного на основе СВРВС, на репродукцию вируса гепатита С (ВГС) в организме лабораторных животных – белых мышей. Ниже мы приводим результаты исследований по изучению противовирусной активности СВРВС на инфекцию, вызванную ВГС у мышей.

Материал и методы:

Вирус. В работе использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования, изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. В исследованиях использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10, 0 ТЦД 50.

Животные. Для изучения противовирусной активности СВРВС использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г. Материал, содержащий ВГС, в дозе 10, 0 ТЦД50 в 0, 2 мл вводили животным внутривенным способом. Часть животных оставляли контрольными. На 9-й день после заражения мышам внутривенно вводили СВРВС в объеме 0, 2 мл. СВРВС вводили мышам 1 раз в день в течение 4-х дней. В опыте использовали по 10 животных на каждый вариант опыта. Через 2 дня, а также через 10 дней после последнего введения СВРВС, по 50% животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани печени и головного мозга использовали для определения антигенов ВГС и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью вируссодержащие пробы титровали в культурах клеток СПЭВ. Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагглютинации (РГА), используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968).

Культуры клеток. Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы «Нарвак», Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл).

Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).

Характеристика СВРВС. В работе использовали физиологический раствор, приготовленный на основе СВРВС. СВРВС имел следующие параметры: окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) — отрицательный, рН-7, 5 – 8, 0. СВРВС был передан нам в герметично укупоренных 200 мл стеклянных флаконах, наполненных «до краев», в виде бесцветного раствора. В опыте использовали по 0, 2 мл СВРВС, который вводили животным внутривенно.

Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах органов и тканей инфицированных мышей, учитывали по результатам титрования, как правило, на 6-7 день после инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.

Результаты. Как видно из данных табл. 1 а, все пробы сывороток крови, гомогенатов печени и головного мозга, полученных от контрольной группы ВГС инфицированных мышей на 17 день после заражения, содержали антигенную активность ВГС. Причем максимальные проявления показателей антигенной активности вируса обнаружены в печени контрольной группы ВГС инфицированных животных, не получавших СВРВС. У животных, которым вводили СВРВС, на 3-й день после последнего введения была отмечена заметная тенденция к снижению титров гемагглютинина ВГС. В частности, показано, что концентрация антигена ВГС в сыворотке крови мышей снизилась почти в 3 раза, более чем в 2 раза – в головном мозге и в 2 раза ниже составляла концентрация антигена в печени ВГС инфицированных животных.

Представляло интерес изучить влияние СВРВС на инфекционные свойства ВГС в тканях и органах ВГС инфицированных животных. Показано, что через 3 дня после последнего введения СВРВС инфекционные титры ВГС в сыворотке крови падали на 3, 3 lg (средние данные).

Близкие результаты, свидетельствующие об эффективности СВРВС, были получены при изучении тканей печени (Табл. 1б). В частности, показано, что инфекционная активность ВГС в тканях печени после 4-кратного введения СВРВС падала на 0, 8 lg . Сокращались и размеры печени и селезенки у ВГС инфицированных мышей под влиянием лечебного эффекта СВРВС (табл. 3).

Наибольшие титры ВГС (до 7, 0 lg ТЦД50 / 20 мкл) наблюдали в тканях головного мозга ВГС инфицированных мышей (табл. 1б). Однако и в этом случае у мышей, получавших СВРВС, наблюдали снижение титров инфекционной активности ВГС на 3, 3 lg.

Таким образом, данные, полученные при изучении органов и тканей мышей на 17 дней после инфекции ВГС и 3-й день после 4-кратного применения СВРВС, свидетельствуют о высокой противовирусной активности СВРВС в отношении инфекции, вызванной ВГС у животных.

В этой связи интересно было выяснить продолжительность положительных изменений в организме ВГС инфицированных мышей после отмены введения СВРВС. Поэтому 2-я группа ВГС инфицированных животных была обследована на 28 день после инфекции и на 11 день после отмены СВРВС.

Полученные результаты приведены в табл. 2 а, б. Исследование антигенной активности ВГС в органах и тканях мышей в этот период времени позволило также установить продолжающийся антивирусный эффект СВРВС. Заметное снижение титров гемагглютинина в сыворотке крови животных, 3-кратное снижение антигена ВГС в печени мышей и более чем 3-кратное снижение в головном мозге животных свидетельствовало о продолжающимся антивирусном эффекте СВРВС даже через 11 дней после отмены его введения.

Изучение инфекционной активности ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей показало, что в отдаленные сроки после завершения лечения антивирусный эффект введенного СВРВС сохранялся в течение более чем 10 дней (более отдаленные сроки не проверялись). Однако анализ полученных данных позволил обнаружить иные закономерности в параметрах инфекции ВГС в эти сроки. В частности, показано, что титры ВГС, содержащиеся в сыворотке крови и в печени контрольной группы животных, в значительной степени превышали эти значения, выявленные в ранние сроки после заражения мышей (на 1, 5 lg – в сыворотке крови, на 2, 4 lg – в печени). В то же время, на 28-й день после ин, екции в тканях головного мозга титры вируса стали заметно снижаться.
Противовирусный эффект СВРВС, определяемый по инфекционной активности ВГС в сроки после отмены его введения, был несколько снижен. Однако наибольший эффект наблюдался при исследовании сыворотки крови, когда титры вируса снижались в среднем на 4, 2 lg, в то же время в печени инфекционные титры ВГС снижались на 0, 9 lg, в головном мозге - на 1, 8 lg.
Таким образом, показано положительное действие СВРВС на снижение показателей инфекции, вызванной ВГС у мышей, и через 10 дней после его отмены.

Заключение

1. Обнаружены антивирусные свойства СВРВС в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в организме белых мышей.
2. Показано, что СВРВС обладает противовирусными свойствами в случае его внутривенного введения в течение 4 дней по 0, 2 мл в день.
3. Антивирусные свойства СВРВС были продемонстрированы с использованием средних данных изучения антигенной и инфекционной активностей ВГС в сыворотке крови, печени и в головном мозге животных, получавших и не получавших СВРВС.
4. Обнаружено, что отмена введения СВРВС животным в течение 10 дней не приводила к полному восстановлению антигенной или инфекционной активностей ВГС в исследуемых органах и тканях.
Концентрация антигена ВГС и его инфекционная активность в органах и тканях животных продолжала оставаться на более низком уровне, чем в контрольной группе ВГС инфицированных животных на протяжении всего периода наблюдения.

Таблица 1. Влияние СВРВС на содержание вируса гепатита С (ВГС) и его антигенов в органах и тканях ВГС инфицированных мышей на 17 день после заражения животных и на 3-й день после отмены введения СВРВС
а) антигенная активность ВГС по данным РГА

б) инфекционная активность ВГС

Таблица 2. Влияние СВРВС на содержание вируса гепатита С (ВГС) и его антигенов в органах и тканях ВГС инфицированных мышей на 28-й день после заражения животных и на 11-й день после отмены введения СВРВС
а) антигенная активность ВГС по данным РГА

б) инфекционная активность ВГС

Таблица 3. Изменения в размерах органов ВГС инфицированных мышей
(размеры длины и ширины органов в см)

Руководитель и ответственный исполнитель:

Литература:

1. П. Г. Дерябин, Е. И. Исаев, А. С. Сухно и Д. К. Львов
Патогенность изолированных вариантов вируса гепатита С (ВГС) для мышей Матер. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиол. и паразитол., 2002, том 3, с. 18

2. П. Г. Дерябин, Е. И. Исаева, А. С. Сухно и др. Действие олипифата на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом гепатита С (ВГС) В монографии: Опыт доклинического исследования на примере олипифата. Под редакцией В. А. Филова и А. М. Берковича, Ника, Санкт. -Петребург, 2002, стр. 145-155.