гепатит с - лечение гепатита - лекарства гепатит - эффективное лечение гепатита с - вирусный гепатит
ГЕПАТИТ С — лечение эффективно и доступно!
Звоните (495) 543-52-09 с 9 до 19 часов по Московскому времени. Воскресенье — выходной. 8-926-530-92-62
отчет
НИИ вирусологии in vitro

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ СТАБИЛИЗИРОВАННОГО ВОДНОГО РАСТВОРА С ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ СТАБИЛИЗИРОВАННОГО ВОДНОГО РАСТВОРА С ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК

ОТЧЕТ

Вирусный гепатит С является глобально распространенной инфекцией. Это медленно прогрессирующее заболевание человека, передаваемое парентеральным путем (через кровь) возбудителем которого является вирус гепатита С (ВГС).

По данным ВОЗ, в среднем около 3% населения мира инфицировано ВГС. В отличие от гепатита В ВГС в 50-80% случаев приводит к хроническому заболеванию печени, а приблизительно у половины хронически инфицированных больных впоследствии развивается цирроз печени или гепатоцеллюлярная карцинома. В последние годы появляется все больше сообщений, свидетельствующих о пантропных свойствах возбудителя гепатита С, т. е. о его способностях поражать не только печень, но и почки, сердечную мышцу, поджелудочную железу, клетки крови человека, центральную нервную систему и другие органы и ткани.

В то же время до сих пор не разработана вакцина против гепатита С, а из лечебных препаратов известны, в основном, интерферон или интерферон в сочетании с виразолом. Лечение этими препаратами характеризуется высокой стоимостью и недостаточно эффективно. Известно, что лишь 25-40% людей, инфицированных ВГС, чувствительны к лечению интерфероном.
Необходим поиск новых недорогих и достаточно эффективных препаратов для лечения больных гепатитом С. Однако до сих пор непреодолимой трудностью было проведение скрининга препаратов на экспериментальных моделях инфекции, вызванной вирусом гепатита С.

Нами впервые разработана модель in vitro для репликации вируса гепатита С, выделены и идентифицированы цитопатогенные варианты ВГС, относящиеся к разным генотипам, в том числе и к наиболее распространенному в стране, наиболее патогенному, инфекции которым трудно поддаются лечению интерфероном, генотипу 1b. Получена острая и хроническая инфекция, вызванная ВГС в культурах клеток, чувствительных к репродукции флавивирусов. Таким образом, появилась уникальная возможность для оценки противирусной активности препаратов на экспериментальной модели, вызванной ВГС в культурах клеток.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке противовирусной активности стабилизированного водного раствора с восстановительными свойствами, поступившего на исследование, на экспериментальной модели инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток.

В работе использовали цитопатогенный штамм вируса гепатита С (ВГС), относящийся к генотипу 1b. Штамм был выделен из сыворотки крови больной хроническим вирусным гепатитом С, идентифицирован как вирус гепатита С. В работе использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10, 0 ТЦД 50/20 мкл.

Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек зеленой мартышки, клон №6 (Vero-6), полученные из лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток Vero-E6 выращивали на двойной среде Игла с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл).

Для титрования остаточной инфекционности вируса использовали перевиваемую линию клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) также чувствительные к репродукции ВГС. Культуры клеток СПЭВ были получены от фирмы «Нарвак», Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 96-лучночных пластиковых панелях для культур клеток. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, антибиотиков.

В работе также использовали культуры клеток тестикул поросенка (ПТП). Культуры клеток ПТП использовали в виде однодневного монослоя, выращенного на 24 и 48-луночных панелях на минимальной среде Игла (фирма Hy Clone, США) с добавлением 10% сыворотки телят, глютамина и антибиотиков.

В работе использовали стабилизированные водные растворы с восстановительными свойствами (далее по тексту – «СВРВС»).

Образец СВРВС №1: окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) – отрицательный, рН – 8, 0, минерализация - 170-190 мг/л. ;

Образец СВРВС №2: окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) – отрицательный, рН – 7, 5, минерализация - 170-190 мг/л. . Образцы СВРВС № 1 и № 2 были переданы нам в 200 мл стеклянных флаконах, наполненных «до краев». Перед началом опыта в образцы СВРВС №1 и № 2 осторожно вращательными движениями растворяли 2 г сухой среды Игла (фирма Hy Clone), после полного расвторения жидкую среду фильтровали медленно, чтобы фильтрат слоился по стенке пробирки. Затем осторожно к фильтрату добавляли 7% сыворотки эмбриона телят, антибиотики. Эта среда, содержащая СЭВВР, служила как средой поддержки, так и питательной средой для инфицированных и неинфицированных культур клеток.

В качестве контрольного опыта использовали те же культуры клеток и вирус, который выращивали на среде, не содержащей СВРВС.


Были проведены следующие исследования:

  1. Изучение цитотоксических свойств СВРВС. С этой целью культуры клеток Vero-E6, СПЭВ и ПТП выращивали и выдерживали на среде, содержащей СВРВС, в течение 4 дней. Полученные результаты изучения жизнеспособности клеток сравнивали с таковыми в культурах клеток, выращиваемых на стандартной среде.
  2. Изучение вирулицидных свойств СВРВС. Вируссодержащую жидкость и питательную среду, содержащую СВРВС, соединяли в соотношении 1:9 соответственно и выдерживали при 40 С в течение 1 часа и 24 часов. Контролем служила вируссодержащая жидкость, соединенная в соотношении 1: 9 с обычной питательной средой, не содержащей СВРВС. Результаты учитывали после титрования остаточной инфекционной активности ВГС в культурах клеток опытных и контрольных образцов.
  3. Изучение противовирусной активности СВРВС.

Противовирусную активность СВРВС исследовали в культурах клеток ПТП по данным изучения а) жизнеспособности инфицированных клеток, выращиваемых на обычной среде и среде, содержащей СВРВС, б) по концентрации инфекционного вируса, продуцируемого клетками, выращиваемых на обычной среде и среде с СВРВС.

РЕЗУЛЬТАТЫ

  1. Изучение цитотоксических свойств СВРВС. Получены данные о том, что среда, содержащая СВРВС, не обладает токсическими свойствами и не влияет на жизнеспособность, пролиферативную активность неинфицированных культур клеток Vero-E6, ПТП и СПЭВ. Более того, получены данные, свидетельствующие о том, что культуры клеток, выращиваемые на СВРВС, характеризуются большей адгезивной способностью монослоя клеток (способность прикрепляться ко дну культурального флакона), что может свидетельствовать и о большей жизнеспособности клеток, культивируемых в этих условиях.
  2. Изучение вирулицидных свойств СВРВС. Эти данные представлены в таблице 1.

Таблица 1. Вирулицидные свойства СВРВС

Культура клеток

Титры ВГС в среде культур клеток, содержащей и не содержащей СВРВС (lg ТЦД 50 /мл)

Контрольная среда

Среда на СВРВС

lg снижения титра ВГС

Vero - E 6 (24 часа)

11, 5

8, 5

3, 0

СПЭВ (1 час)

6, 3

4, 0

2, 3

ПТП (24 часа)

2, 8

№ 1 - 0
№ 2 - 0, 5

2, 8
2, 3

24 часа - инкубация вируса в течение 24 часов при +40 С, 1 час – в течение 1 часа в тех же условиях; № 1 и № 2 - образцы СВРВС.

Как видно из данных табл. 1, экспозиция ВГС-содержащего материала в среде, содержащей СВРВС в течение 24 часов при + 40 С, приводила к снижению инфекционной активности вируса для культур клеток разного происхождения на 2, 8 – 3, 0 lg ТЦД50. Несколько ниже активность СВРВС проявлялась при экспозиции в течение 1 часа (снижение титров ВГС на 2, 3 lg ТЦД50). Таким образом, данные представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что среда Игла, приготовленная на СВРВС, характеризуется вирулицидной активностью.

3. Антивирусные свойства СВРВС в отношении инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток ПТП.

Данные исследования антивирусных свойств СВРВС представлены в таблицах 2, 3, 4.

Таблица 2. Жизнеспособность ВГС инфицированных культур клеток ПТП, культивируемых на среде, содержащей СВРВС Внесение среды, содержащей СВРВС сразу же после заражения клеток ВГС.

Варианты опыта

% выживших ВГС инфицированных клеток в повторных экспериментах на 3-й день после заражения

а

б

в

Опыт № 1

100

100

100

Опыт № 2

100

75

100

Опыт № 3

50

50

50

Контроль клеток

100

100

100

Опыт №1 – использование образца СВРВС № 1
Опыт №2 - использование образца СВРВС № 2
Опыт №3 - использование стандартной тридистилированной воды;
а, б, в - повторные исследования.

Обнаружено, что выращивание ВГС инфицированных культур клеток ПТП на среде, содержащей СВРВС, добавленную сразу же после заражения клеток, приводит, как правило, к 100% выживаемости клеток. В это время в контрольных опытах к этому дню 50% ВГС инфицированных клеток моно слоя погибало. Эти данные свидетельствуют в пользу антивирусных свойств СВРВС.

Таблица 3. Жизнеспособность ВГС инфицированных культур клеток ПТП, культивируемых на среде, содержащей СВРВС (Внесение среды, содержащей СВРВС, за 24 часа до заражения клеток ВГС)

Варианты опыта

% выживших ВГС инфицированных клеток в повторных экспериментах на 3-й день после заражения

а

б

в

Опыт №1

100

100

100

Опыт №2

100

100

100

Опыт №3

50

50

50

Контроль клеток

100

100

100

Опыт №1 – использование образца СВРВС № 1
Опыт №2 - использование образца СВРВС № 2
Опыт №3 - использование стандартной тридистилированной воды;
а, б, в - повторные исследования.

Из данных таблицы 3 видно, что выращивание ВГС инфицированных культур клеток ПТП на среде, содержащей СВРВС, добавленную за 24 часа до заражения клеток, также приводит к 100% выживаемости клеток. В это время в контрольных опытах к этому дню 50% ВГС инфицированных клеток моно слоя погибало. Эти данные также свидетельствуют в пользу антивирусных свойств СВРВС.

Понятно, что данные таблиц 2 и 3 вряд ли могут напрямую свидетельствовать об антивирусных свойствах СВРВС, так как известно, что снижение цитопатогенного действия вируса не означает, что клетки не продолжают активно продуцировать инфекционный вирус. Это свойство особенно характерно для вируса гепатита С, склонного к формированию хронической или персистентной инфекции в различных типах клеток.

Таблица 4. противовирусная активность СВРВС на модели инфекции ВГС в культурах клеток ПТП

Время добавления среды, содержащей СВРВС
Титры вируса гепатита С ( lg ТЦД 50 /мл для культур клеток СПЭВ ) в пробах среды, отобранных из культур клеток ПТП на 3-й день после инфекции
Опыт №1
Опыт №2
Опыт № 3
а
б
а
б
а
б
lg снижения титра ВГС
В момент инфекции
1, 5
1, 5
1, 5
0, 8
5. 0
5, 2
3, 5 – 4, 4
За 24 часа до инфекции
4, 3
4, 3
4, 3
3, 3
7, 0
6, 9
2, 7 – 3, 7

Примечание: Обозначения те же, что и в табл. 2 и 3.

3) Для прямой оценки противовирусного действия СВРВС в культурах клеток ПТП, инфицированных ВГС, на 3-й день после инфекции пробы среды отбирали и титровали на культурах клеток ПТП. Данные табл. 4 представляют результаты титрования проб культуральной среды.

Показано, что СВРВС обладает противовирусными свойствами. В частности, обнаружено, что наибольшей противовирусной активностью СВРВС обладает в случае обработки им клеток как в момент заражения, так и за 24 час до заражения культур клеток ВГС. В этих случаях титры вируса в культурах клеток, обработанных СВРВС сразу же после инфекции, снижались на 3, 5 – 4, 4lg ТЦД50. Обработка клеток СВРВС за 24 часа до заражения клеток, как правило, также приводила к существенному антивирусному эффекту СВРВС (снижение титров ВГС на 2, 7 – 3, 7 lg ТЦД50).

4) Изучение вирулицидной и противовирусной активности СВРВС из флаконов, не полностью наполненных СВРВС и соприкасающимся с воздухом.

В этих опытах, как правило, использовали СВРВС, оставшийся во флаконах от прежних экспериментов через 24 часа его экспозиции с воздухом при сохранении стерильных условий (стерильно закрытые флаконы).

В частности, было показано, что в случае «аэрации» СВРВС во флаконах в течение 24 часов он терял полностью вирулицидные и антивирусные свойства в отношении вируса гепатита С.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

  1. СВРВС не обладает цитотоксическими свойствами для культур клеток Vero-E6, СПЭВ, ПТП в течение 4 и более дней культивирования.
  2. СВРВС обладает вирулицидной активностью в отношении вируса гепатита С при экспозиции ВГС-содержащей жидкости и среды Игла, приготовленной на СВРВС, в течение 1 часа и 24 часов, титры ВГС для культур клеток снижаются на 2, 3 – 3, 0 lg ТЦД50.
  3. СВРВС обладает противовирусными свойствами и способен снижать продукцию ВГС инфицированными клетками в среднем на 3, 0 – 4, 0 lg при добавлении его сразу же после адсорбции ВГС на клетки или за 24 часа до инфекции клеток вирусом гепатита С.
  4. Вирулицидные и антивирусные свойства СВРВС полностью утрачивались в случае его аэрации в течение 24 часов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что скорее всего антивирусные свойства СВРВС не связаны только с его вирулицидными свойствами, так как снижение инфекционной активности ВГС наблюдалось более существенным при изучении его антивирусных свойств по сравнению с вирулицидной активностью СВРВС.

Руководитель и ответственный исполнитель:

Rambler's Top100
При цитировании информации активная ссылка на www.gepatitunet.ru обязательна!
© «Редокс Технологии». Все права защищены.